Az emberi multidrog rezisztencia fehérjék működése és fiziológiás szerepe = Molecular mechanism and physiological function of the human multidrug resistance proteins

A pályázat keretében az emberi multidrog rezisztens fehérjék (MRP) működési mechanizmusát és fiziológiás szerepét vizsgáltuk. Korábbi adataink szerint az MRP fehérjékben az N aktív centrum nagyobb affinitással köti az ATP-t, a C aktív centrum pedig az ATP hidrolízisében aktívabb. Kísérleteinkben a két aktív centrum funkcionális különbségének szerkezeti alapjait vizsgáltuk. Az MRP fehérjék ABC doménjainak szekvenciáját összehasonlítva két olyan régiót találtunk, amelyekben a két ABC domén konzerváltan eltér egymástól. Olyan MRP1 mutánsokat készítettünk, amelyekben ezen regiókban lévő eltérő aminosavakat az egyik ABC doménban kicseréltük a másik ABC domén megfelelő aminosavaival. A mutánsokat expressziós rendszerben magas szinten expresszáltuk, majd megvizsgáltuk a mutációk hatását a transzport aktivitásra. Adataink szerint a C-ABC domén Walker A régióját és az N-ABC domén signature régióját érintő aminosav csere külön-külön parciálisan, míg együttesen drasztikusan csökkenti a fehérje aktivitását. Az N-ABC Walker A régióját érintő csere nem befolyásolja, míg a C-ABC signature régiójában végzett csere eliminálja a fehérje aktivitását, ami azonban az N-ABC Walker A-t érintő mutáció egyidejű bevitelére helyreáll. Eredményeink alapján feltételezzük, hogy az N-ABC Walker A es a C-ABC signature régiójának monitorozott, - a C-ABC Walker A es N-ABC signature megfelelő aminosav párjától eltérő - aminosavpárja hozzájárul, hogy az N aktív centrum gyengébb hidrolitikus tulajdonságú. | A pályázat keretében az emberi multidrog rezisztens fehérjék (MRP) működési mechanizmusát és fiziológiás szerepét vizsgáltuk. Korábbi adataink szerint az MRP fehérjékben az N aktív centrum nagyobb affinitással köti az ATP-t, a C aktív centrum pedig az ATP hidrolízisében aktívabb. Kísérleteinkben a két aktív centrum funkcionális különbségének szerkezeti alapjait vizsgáltuk. Az MRP fehérjék ABC doménjainak szekvenciáját összehasonlítva két olyan régiót találtunk, amelyekben a két ABC domén konzerváltan eltér egymástól. Olyan MRP1 mutánsokat készítettünk, amelyekben ezen regiókban lévő eltérő aminosavakat az egyik ABC doménban kicseréltük a másik ABC domén megfelelő aminosavaival. A mutánsokat expressziós rendszerben magas szinten expresszáltuk, majd megvizsgáltuk a mutációk hatását a transzport aktivitásra. Adataink szerint a C-ABC domén Walker A régióját és az N-ABC domén signature régióját érintő aminosav csere külön-külön parciálisan, míg együttesen drasztikusan csökkenti a fehérje aktivitását. Az N-ABC Walker A régióját érintő csere nem befolyásolja, míg a C-ABC signature régiójában végzett csere eliminálja a fehérje aktivitását, ami azonban az N-ABC Walker A-t érintő mutáció egyidejű bevitelére helyreáll. Eredményeink alapján feltételezzük, hogy az N-ABC Walker A es a C-ABC signature régiójának monitorozott, - a C-ABC Walker A es N-ABC signature megfelelő aminosav párjától eltérő - aminosavpárja hozzájárul, hogy az N aktív centrum gyengébb hidrolitikus tulajdonságú

Öt lipid transzporter (ABCC6, ABCG5, ABCG8, ABCG1 és ABCG4) vizsgálata: szerkezet, transzport mechanizmus, fiziológiai szerepük és sejten belüli lokalizációjuk = Structure, transport mechanism, physiological role and subcellular localization of five lipid transporters (ABCC6, ABCG5, ABCG8, ABCG1 and ABCG4).

Elsőként sikerült feltárnunk a humán ABCC6 gén transzkripciós szabályozásának fő vonásait. Modelt állítottunk fel, amely segítségével megmagyarázható, hogy a különös evoluciós események révén keletkezett ABCC6 pseudogének hogyan járulnak hozzá a génben keletkező mutációkhoz. Feldolgoztuk és meghatároztuk a humán ABC-fehérjék membrán-topológiáját. Létrehoztuk a humán ABCC6 fehérje homológiai modelljét. Első sikerült biokémiai bizonyítékkal szolgálnunk az ABCG5-G8 heterodimérként való működésére. Kimutattuk, hogy az ABCG2 transzporter aktivitását specifikus módon és jelentős mértékben fokozza a membrán koleszterin-telítése. A transzporter koleszterin-érzékenysége egy merőben újszerű szabalyozómechanizmust feltételez. Feltártuk az ABCG2 és a tirozinkináz gátló tipusú, klinikailag kiemelkedő fontosságú rákellenes szerek kölcsönhatását. Az ABC-fehérjéknek a chemo-immunitást biztosító hálózatban betöltött szerepét leíró hipotézist dolgoztunk ki, és azt egy terjedelmes review-cikk kereteiben az élettudományok egyik legrangosabb, igen magas impaktfaktorú folyóiratában fejtettük ki. Húsz közleményt jelentettünk meg az adott időszakban, amelyek összesített impakt faktora 117. | We have revealed, the very first time, the basics of the transcriptional regulation of the human ABCC6 gene. We have a developed a model expaining how the evolutionary scenario of the human ABCC6 gene contributed to the disease-causing mutations of the gene. We have determined the mebrane topology of the human ABC protein family members. We have constructed a homology model of the ABCC6 protein. We showed that the human ABCG5 and ABCG8 works as a heterodimer providing the first biochemical proof of its activity. We have found that the transport activity of the human ABCG2 protein can be significatly increased by uploading the membrane with cholesterol. This finding raises the possibility of a novel regulatory mechanism of the transporter's activity. We have described the details of the interactions between the new-type tyrosinekinase inhibitor anticancer drugs and the multidrug transporter, ABCG2. We have developed a hypothesis describing the specific role of ABC transporter in a defense mechanism, called 'chemo-immunity'. We have published this new idea in a leading journal with outstandig reputation and very high impact factor. We have published twenty papers during the given period with total impact factor of 117

The ABCC6 Transporter: A New Player in Biomineralization

Pseudoxanthoma elasticum (PXE) is an inherited metabolic disease with autosomal recessive inheritance caused by mutations in the ABCC6 gene. Since the first description of the disease in 1896, alleging a disease involving the elastic fibers, the concept evolved with the further discoveries of the pivotal role of ectopic mineralization that is preponderant in the elastin-rich tissues of the skin, eyes and blood vessel walls. After discovery of the causative gene of the disease in 2000, the function of the ABCC6 protein remains elusive. More than 300 mutations have been now reported and the concept of a dermal disease has progressively evolved toward a metabolic disorder resulting from the remote effects caused by lack of a circulating anti-mineralization factor. Very recently, evidence has accumulated that this anti-mineralizing factor is inorganic pyrophosphate (PPi). This leads to decreased PPi/Pi (inorganic phosphate) ratio that results from the lack of extracellular ATP release by hepatocytes and probably renal cells harboring the mutant ABCC6 protein. However, the mechanism by which ABCC6 dysfunction causes diminished ATP release remains an enigma. Studies of other ABC transporters, such as ABCC7 or ABCC1 could help our understanding of what ABCC6 exact function is. Data and a hypothesis on the possible roles of ABCC6 in acquired metabolic diseases are also discussed

In vitro transport of methotrexate by Drosophila Multidrug Resistance-associated Protein

Methotrexate (MTX) is a widely used chemotherapeutic agent, immune suppressant and antimalarial drug. It is a substrate of several human ABC proteins that confer multidrug resistance to cancer cells and determine compartmentalization of a wide range of physiological metabolites and endo or xenobiotics, by their primary active transport across biological membranes. The substrate specificity and tissue distribution of these promiscuous human ABC transporters show a high degree of redundancy, providing robustness to these key physiological and pharmacological processes, such as the elimination of toxins, e.g. methotrexate from the body. A similar network of proteins capable of transporting methotrexate has been recently suggested to exist in Drosophila melanogaster. One of the key players of this putative network is Drosophila Multidrug-resistance Associated Protein (DMRP). DMRP has been shown to be a highly active and promiscuous ABC transporter, capable of transporting various organic anions. Here we provide the first direct evidence that DMRP, expressed alone in a heterologous system lacking other, potentially functionally overlapping D. melanogaster organic anion transporters, is indeed able to transport methotrexate. Our in vitro results support the hypothesized but debated role of DMRP in in vivo methotrexate excretion. © 2018 Karasik et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited

Oral administration of pyrophosphate inhibits connective tissue calcification

Various disorders including pseudoxanthoma elasticum (PXE) and generalized arterial calcification of infancy (GACI), which are caused by inactivating mutations in ABCC6 and ENPP1, respectively, present with extensive tissue calcification due to reduced plasma pyrophosphate (PPi). However, it has always been assumed that the bioavailability of orally administered PPi is negligible. Here, we demonstrate increased PPi concentration in the circulation of humans after oral PPi administration. Furthermore, in mouse models of PXE and GACI, oral PPi provided via drinking water attenuated their ectopic calcification phenotype. Noticeably, provision of drinking water with 0.3 mM PPi to mice heterozygous for inactivating mutations in Enpp1 during pregnancy robustly inhibited ectopic calcification in their Enpp1-/- offspring. Our work shows that orally administered PPi is readily absorbed in humans and mice and inhibits connective tissue calcification in mouse models of PXE and GACI PPi, which is recognized as safe by the FDA, therefore not only has great potential as an effective and extremely low-cost treatment for these currently intractable genetic disorders, but also in other conditions involving connective tissue calcification

Boosted coupling of ATP hydrolysis to substrate transport upon cooperative estradiol-17-beta-D-glucuronide binding in a Drosophila ATP binding cassette type-C transporter

ATP binding cassette type-C (ABCC) transporters move molecules across cell membranes upon hydrolysis of ATP; however, their coupling of ATP hydrolysis to substrate transport remains elusive. Drosophila multidrug resistance-associated protein (DMRP) is the functional ortholog of human long ABCC transporters, with similar substrate and inhibitor specificity, but higher activity. Exploiting its high activity, we kinetically dissected the catalytic mechanism of DMRP by using E2-d-glucuronide (E2G), the physiologic substrate of human ABCC. We examined the DMRP-mediated interdependence of ATP and E2G in biochemical assays. We observed E2G-dependent ATPase activity to be biphasic at subsaturating ATP concentrations, which implies at least 2 E2G binding sites on DMRP. Furthermore, transport measurements indicated strong nonreciprocal cooperativity between ATP and E2G. In addition to confirming these findings, our kinetic modeling with the Complex Pathway Simulator indicated a 10-fold decrease in the E2G-mediated activation of ATP hydrolysis upon saturation of the second E2G binding site. Surprisingly, the binding of the second E2G allowed for substrate transport with a constant rate, which tightly coupled ATP hydrolysis to transport. In summary, we show that the second E2G binding-similar to human ABCC2-allosterically stimulates transport activity of DMRP. Our data suggest that this is achieved by a significant increase in the coupling of ATP hydrolysis to transport.-Karasik, A., Ledwitch, K. V., Aranyi, T., Varadi, A., Roberts, A., Szeri, F. Boosted coupling of ATP hydrolysis to substrate transport upon cooperative estradiol-17-beta-D-glucuronide binding in a Drosophila ATP binding cassette type-C transporter

Impact of copper and iron binding properties on the anticancer activity of 8-hydroxyquinoline derived Mannich bases.

The anticancer activity of 8-hydroxyquinolines relies on complex formation with redox active copper and iron ions. Here we employ UV-visible spectrophotometry and EPR spectroscopy to compare proton dissociation and complex formation processes of the reference compound 8-hydroxyquinoline (Q-1) and three related Mannich bases to reveal possible correlations with biological activity. The studied derivatives harbor a CH2-N moiety at position 7 linked to morpholine (Q-2), piperidine (Q-3), and chlorine and fluorobenzylamino (Q-4) substituents. Solid phase structures of Q-3, Q-4·HCl·H2O, [(Cu(HQ-2)2)2]·(CH3OH)2·Cl4·(H2O)2, [Cu(Q-3)2]·Cl2 and [Cu(HQ-4)2(CH3OH)]·ZnCl4·CH3OH were characterized by single-crystal X-ray diffraction analysis. In addition, the redox properties of the copper and iron complexes were studied by cyclic voltammetry, and the direct reaction with physiologically relevant reductants (glutathione and ascorbic acid) was monitored. In vitro cytotoxicity studies conducted with the human uterine sarcoma MES-SA/Dx5 cell line reveal the significant cytotoxicity of Q-2, Q-3, and Q-4 in the sub- to low micromolar range (IC50 values 0.2-3.3 μM). Correlation analysis of the anticancer activity and the metal binding properties of the compound series indicates that, at physiological pH, weaker copper(ii) and iron(iii) binding results in elevated toxicity (e.g.Q4: pCu = 13.0, pFe = 6.8, IC50 = 0.2 μM vs.Q1: pCu = 15.1, pFe = 13.0 IC50 = 2.5 μM). Although the studied 8-hydroxyquinolines preferentially bind copper(ii) over iron(iii), the cyclic voltammetry data revealed that the more cytotoxic ligands preferentially stabilize the lower oxidation state of the metal ions. A linear relationship between the pKa (OH) and IC50 values of the studied 8-hydroxyquinolines was found. In summary, we identify Q-4 as a potent and selective anticancer candidate with significant toxicity in drug resistant cells

Az ABC-fehérjék Tudományos Iskolája: a gének regulációjától a transzport-mechanizmusig = The School of ABC-proteins: From Gene Regulation to Transport Mechanism

Megállapítottuk, hogy az ABCC6 gén duplikációi a low-copy repeat 16a elemekhez kötődnek, és ilyen duplikációk több alkalommal is bekövetkeztek különböző főemlős fajokban. Populációgenetikai vizsgálatunkban kimutattuk, hogy egy inaktív ABCC6 allél növeli a koronáriás artéria betegség (CAD) kialakulásának esélyét. Az ABCC6 expressziójánk szabályozását is vizsgáltuk, megállapítottuk, hogy az ERK1/2 szignál-útvonal és a HNF4 transzkripciós faktor felelős az ABCC6 szövet-specifikus szabályozásáért. Megalkottuk az ABCC6 transzporter homológia modelljét, és tanulmányoztuk az ismert 119 misszensz PXE-t okozó mutáció eloszlását. A komplex domén-domén határfelületeken a misszensz mutációk jelentős feldúsúlását figyeltük meg, ami ezen kapcsolatok fontosságának genetikai bizonyítéka. Az ABCC6 viszgálatára alkalmas új állat modellt fejlesztettünk ki: a zebrahal (Danio rerio) modell-rendszert. Bemutattuk, hogy az ecetmuslica MRP az ortológ humán ABCC fehérjékhez hasonló biokémiai tulajdonságokkal rendelkezik, így azok magas turnover-rel rendelkező modellje. Megfigyeltük, hogy a koleszterin szelektíven módosítja az ABCG2 aktivitását. Tanulmányoztuk az ABCG2 katalitikus ciklusa során fellépő intramolekuláris átrendeződéseket. Kifejlesztettünk egy sejtes modell-rendszert az ABCA1, egy fontos koleszterin transzporter tanulmányozására. Új módszert fejlesztettünk ki a kvantitatív PCR reprodukálhatóságának javítására. 15 közleményt publikáltunk szakmailag lektorált nemzetközi folyóiratokban. | We established that duplications of ABCC6 are associated to low-copy repeat 16a and such duplications have occurred several times in different primates. Our population genetic study revealed that one inactive allele of ABCC6 increases the risk of coronary artery disease (CAD) significantly. Th signal transduction pathways leading to the modulation of ABCC6 expression have also been deciphered: the ERK1/2 pathway and HNF4 are responsible for the tissue-specific regulation of ABCC6. We have built a homology model of this transporter, and analyzed the distribution of the known 119 missense PXE-associated mutations within the structure. Significant clustering of the missense mutations has been found at domain-domain interfaces providing a genetic proof of the importance of these domain-domain interactions. A novel animal model to investigate ABCC6 has been developed: the zebrafish (Danio rerio) model system. We have demonstrated that the Drosophila MRP shares the biochemical features of its human ABCC orthologues and serves as a high turn-over model protein of human ABCC-type transporters. We have found that cholesterol selectively modulates the activity of ABCG2. We have studied the intramolecular rearrangments during the catalytic cycle of ABCG2. We have developed a cellular model system to study ABCA1, an important cholesterol transporter. We have developed a novel method to improve the quantitative PCR technique. We have published 15 papers in peer-reviewed international journals

Inhibition of DNA methyltransferase leads to increased genomic 5-hydroxymethylcytosine levels in hematopoietic cells.

5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) is produced from 5-methylcytosine (5mC) by Ten-eleven translocation (TET) dioxygenases. The epigenetic modification 5hmC has crucial roles in both cellular development and differentiation. The 5hmC level is particularly high in the brain. While 5mC is generally associated with gene silencing/reduced expression, 5hmC is a more permissive epigenetic mark. To understand its physiological function, an easy and accurate quantification method is required. Here, we have developed a novel LC-MS/MS-based approach to quantify both genomic 5mC and 5hmC contents. The method is based on the liberation of nucleobases by formic acid. Applying this method, we characterized the levels of DNA methylation and hydroxymethylation in mouse brain and liver, primary hepatocytes, and various cell lines. Using this approach, we confirm that the treatment of different cell lines with the DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2\u27-deoxycytidine leads to a decrease in 5mC content. This decrease was accompanied by an increase in 5hmC levels in cell lines of hematopoietic origin. Finally, we showed that ascorbate elevates the levels of 5hmC and augments the effect of 5-aza-2\u27-deoxycytidine without significantly influencing 5mC levels